El hongo Nepestalotiopsis sp, ha sido reportado en zonas productoras de fresa (Fragaria x ananassa), en el altiplano central de Guatemala como el agente causal de la pudrición de la corona del tallo de la planta. Los síntomas que presenta son, coloración rojiza internerval en las hojas viejas, necrosis en pecíolos, escaso desarrollo vegetal, marchitez y muerte de la planta, lo que provoca un daño del 70 % en las parcelas, incrementando las pérdidas y el costo de producción. El estudio tuvo como objetivo el aislar e identificar la diversidad genética de Neopestalotiopsis sp, en cinco municipios de Chimaltenango. Se recolectaron plantas completas que presentaron síntomas de la enfermedad, en parcelas de productores. En el laboratorio de Protección Vegetal del ICTA - CEPALO, se procesaron las muestras, seleccionando raíces y corona con presencia de necrosis. Sembrando in vitro explantes de raíz y corona de cinco milímetros, en medio papa dextrosa agar (PDA) suplementado con estreptomicina se incubaron por 15 días a 25°C y se purificó cada aislamiento. Como resultados se obtuvieron 76 aislamientos de Neopestalotiopsis sp, provenientes de cinco municipios Tecpán, Santa Apolonia, Santa Cruz Balanyá, Comalapa y Zaragoza. De estos, se seleccionaron 20 aislamientos que se caracterizaron genéticamente. La amplificación de ADN y secuenciación de la región ITS de su genoma identificó que todos los aislamientos corresponden a Neopestalotiopsis clavispora,determinando que es la única especie de este género en el área de estudio, se recomienda evaluar variedades resistentes a este patógeno para mitigar el impacto en producción.